科研 | Mol Neurodegener：AIF3剪接开关触发神经退行性疾病

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导读

凋亡诱导因子（AIF）作为一种线粒体黄素蛋白，在线粒体生物能量学中起着重要的作用，在缺血性中风或神经退行性疾病时，它一旦从线粒体释放并转运到细胞核，即介导caspase非依赖性细胞死亡。尽管AIF的选择性剪接调控已被证实，但在病理条件下AIF剪接亚型的诱导以及它对成年脑线粒体功能和神经退行性疾病的影响尚不清楚。本研究中，我们鉴定了一种缺失外显子2和3的天然剪接AIF亚型，命名为AIF3。AIF3在生理条件下是无法检测到的，但在小鼠和人中风后的死脑中表达增加。AIF3在小鼠脑内的剪接导致脑室扩大和前脑严重的神经退行性疾病，这些AIF3剪接小鼠在出生后24个月死亡。AIF3剪接引发了神经退行性疾病涉及线粒体功能障碍和AIF3核易位。我们发现AIF3抑制NADH氧化酶活性、ATP生成、氧消耗和线粒体生物发生。此外，AIF3的表达显著增加染色质浓缩和核收缩，导致神经细胞死亡。然而，在花斑眼镜蛇中单独缺失AIF或在AIF3基因敲除小鼠中单独获得AIF3并没有像在AIF3剪接小鼠中观察到的那样引起强烈的神经退行性疾病。我们确定AIF3是一种疾病诱导的亚型，并建立了AIF3剪接小鼠模型。AIF3剪接诱导的神经退行性疾病的分子机制包括线粒体功能障碍和AIF3核易位，这是AIF丢失和AIF3获得的协同作用结果。我们的研究为理解AIF3剪接在大脑中的作用提供了一个有价值的工具，同时也为预防/延缓神经退行性疾病的进展提供了一个潜在的治疗靶点。

论文ID

原名：AIF3 splicing switch triggers neurodegeneration译名：AIF3剪接开关触发神经退行性疾病
期刊：Molecular Neurodegeneration
IF：9.599发表时间：2021.04通讯作者：Yingfei Wang、Valina L. Dawson
通讯作者单位：德克萨斯大学西南医学中心、约翰霍普金斯大学医学院

实验设计

实验结果

1. 一种新的AIF亚型AIF3的鉴定
为了探索AIF在成人大脑中的功能，我们将小鼠Aifm1的外显子3与loxP（AIF^fl/fl）连接（图1a和补充图1a），并将AIF^fl/fl小鼠与CamKIIα-iCre小鼠杂交。AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠中62 kDa的成熟AIF蛋白的皮层、海马、纹状体、丘脑、下丘脑和中脑显著减少，但小脑和脑干没有减少（图1b）。这与CamKIIα基因的表达分布一致，主要存在于成人前脑。出乎意料的是，我们在AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠所有脑区都检测到另外一个57 kDa的AIF蛋白，但在AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-小鼠没有检测到，首次观察是在出生后第20天（P20）（补充图1b），并持续观察约3个月直至死亡（图1b）。57 kDa蛋白被至少三种针对AIF不同氨基酸序列的不同AIF抗体识别（图1b、补充图1b、c和表1），但我们在AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠的其他器官中未观察到，包括心、肺、肝和肢体（补充图1d），或在CamKIIα-iCre+对照小鼠的任何脑区（补充图1e），这些结果暗示57 kDa蛋白可能是一种新的AIF亚型。为了确定AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠中是否诱导了一种新的AIF亚型，我们从AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠大脑及其同窝对照组（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）中制备cDNAs，并使用特异于Aifm1基因外显子1和16的引物进行PCR（PCR ID-mAIF，表2）。在AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠的皮层中我们检测到第二个小的1697 bp的PCR产物以及全长AIF cDNA（1940 bp）（图1c）。Sanger测序分析显示，这个较小的cDNA编码缺少外显子2和3的AIF（图1c和补充图1f，g），并且被称为AIF3以区别于其他两个先前表征的AIF亚型。为了进一步确定这个57 kDa的AIF3蛋白是否是一种新的AIF亚型而不是降解产物，我们从E13的AIF^fl/Y/AIF^fl/fl小鼠胚胎制备MEF，并用Cre慢病毒感染MEF以诱导内源性AIF3剪接，并建立多个表达AIF3剪接而不是AIF的单克隆（图1d）。免疫沉淀AIF^fl/Y/Cre-中的AIF蛋白；AIF^fl/fl/Cre-MEFs（野生型，WT）和AIF^fl/Y/Cre+；AIF^fl/fl/Cre+克隆3个MEF用于自下而上的蛋白质组学分析。我们分析了AIF肽，特别是外显子4与其上游外显子（包括外显子1和3）之间的肽键（图1e）。我们在AIF^fl/fl/Cre+clone3 MEFs中特异性检测到外显子1和4之间的肽链LPA-TEGGSVPQIR，但在WT MEFs中没有检测到（图1f，g）。相反，外显子3和4之间的肽链AIASATEGGSVPQIR仅在WT MEFs中检测到（图1f，g）。在WT和AIF^fl/Y/Cre+中我们观察到Aifm1外显子4-16编码的多肽；AIF^fl/fl/Cre+克隆3个MEF。总的来说，mRNA分析和自下而上的蛋白质组学分析显示在AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+和AIF^fl/fl/CamKIIα-iCre+小鼠的大脑中存在一个新的57 kDa的AIF3亚型。 图1 一种新型AIF亚型AIF3的鉴定
a，小鼠Aifm1基因第3外显子条件缺失策略。第一行和第二行显示了Aifm1基因座的部分限制性图谱和靶向载体。小鼠Aifm1基因的外显子显示为黑框并标记。外显子3的两侧是由三角形表示的loxP序列。frt位点两侧的G418抗性基因（Neo）用开放框表示。在靶向载体的5端插入粗线所示的PGK-单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK），显示了用于克隆的限制性内切酶位点（SphI、EcoRl、XbaI、BglII）。同源重组引入了一个外显子3和Neo，在正确重组的ES克隆中通过flpE重组酶的瞬时过表达将其切除。Aifm1等位基因中的外显子3通过与以脑特异性方式表达Cre重组酶的小鼠交配进一步切除。b，用JHU-532 AIF抗体检测CamKIIα-iCre重组后AIF3在AIF^fl/Y小鼠P70不同脑区的表达。以62 kDa成熟AIF (Δ53 aa)和57 kDa截断AIF (Δ103 aa)为标记，其中增加了一个8 aa连接子。c，使用AIF基因特异性引物对其外显子1和外显子16（PCR ID：mAIF，表2）和从WT（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）和AIF3（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）小鼠制备的cDNA进行AIF3的mRNA表达和序列分析，以P20为模板。d，用E1-AIF抗体建立AIF^fl/Y/AIF^fl/fl小鼠AIF3-MEFs单细胞系。e，AIF肽桥接外显子1/2、外显子3/4和外显子1/4。f&g，AIF和AIF3肽分别桥接外显子3/4和外显子1/4的MS/MS谱。 表1 不同AIF抗体的抗原
2. AIF3是一种自然剪接亚型，在小鼠和人类中风后诱导形成
为了确定AIF3是否是一种天然剪接异构体，我们使用从C57BL/6小鼠脑制备的cDNA来扩增AIF的5’末端，进行了5’RACE分析，这是一种检测天然次要异构体的方法（图2a）。所有三种AIF亚型，包括AIF、AIF2和AIF3，均通过5’RACE鉴定（图2b），表明AIF3是一种天然剪接亚型。尽管在生理条件下，小鼠大脑中AIF3的mRNA和蛋白质水平低于检测限（图1b，c），但我们发现大脑中动脉闭塞（MCAO）2小时后，在同侧大脑中AIF3蛋白被诱导24小时（图2c和补充图2a）。我们使用识别AIF外显子1和5的引物（mAIF-Fw34/Re648，表2），在中风组和假手术组中检测到AIF mRNA，但是在缺血性中风的脑中发现AIF3 mRNA上调（图2d）。Sanger测序证实了从外显子1到5得到的AIF3 PCR产物。外显子1和4之间的连接序列在缺血小鼠脑中被明显检测到（图2e）。为了避免AIF的干扰，我们设计了一个AIF3特异性PCR引物（mAIF-Fw2E1/4）来识别外显子1和4的连接（图2f，g）。使用AIF3特异性PCR引物（PCR ID-mAIF3，表2），我们发现小鼠脑缺血2 h后再灌注6 h时AIF3 mRNA被诱导，再灌注24 h时AIF3 mRNA进一步升高，而在对照假手术小鼠中未明显检测到AIF3 mRNA（图2g）。与mRNA诱导一致，AIF3蛋白水平在中风后24小时增加，其上调在小鼠大脑中至少持续72小时（图2h，i）；相反，用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA，500 μM）、staurosporine（STS，1 μM）、缺氧葡萄糖剥夺（OGD，90 min）或缺氧（1%O₂，24-72 h）的处理，在培养的皮层神经元中未诱导AIF3表达（补充图2b，c，d）。为了确定AIF3的潜在临床相关性，我们分析了年龄在20天到73岁的缺氧缺血性或出血性中风男性和女性患者的大脑额叶皮质中AIF3的表达（补充图2e）。我们使用AIF3特异性引物（PCR ID-hAIF3，表2），在所有5名受试患者中观察到AIF3 mRNA的表达，并通过Sanger测序进一步证实（图2j，补充图2e）。在这些缺氧缺血性损伤患者中，AIF3蛋白表达也增加（图2k，l，补充图2e）。相反，在对照人脑组织中我们检测到少量AIF3 mRNA和蛋白表达（图2j，k，l）。这些数据表明，AIF3是一种新的AIF剪接异构体，在小鼠和人类缺氧缺血性损伤后在脑内诱导。 图2 在小鼠和人类缺血性中风模型中诱导AIF3
a，C57BL/6小鼠脑AIF-cDNAs的5′-RACE方案。b，所有三种AIF亚型均由5′-RACE鉴定。c，C57BL/6小鼠脑缺血2h后24h脑内AIF3蛋白的表达。PC（阳性对照），AIF3（AIFfl/Y/CamKIIα-iCre+）小鼠小脑裂解物。d，使用普通AIF/AIF3引物在缺血性中风小鼠皮层中表达AIF3 mRNA（mAIF-Fw34/Fe648，表2）。上图为20个周期的第1个PCR，中图为以第1个PCR的AIF3为模板的第2个PCR，下图为GAPDH。e，缺血性脑卒中小鼠皮层AIF3 mRNA的Sanger序列测定。f，AIF3 mRNA特异性引物设计的方案。g，使用AIF3特异性引物在缺血性中风小鼠皮层中表达AIF3 mRNA（PCR ID：mAIF3，表2）。h，AIF-E1抗体检测缺血性脑卒中小鼠脑缺血2 h后24h、48h和72h皮层中AIF3蛋白的表达。i，2 h MCAO后6-72 h缺血性中风小鼠皮层中AIF3蛋白表达的定量。AIF3蛋白水平标准化为肌动蛋白，并表示为相对强度。j，使用AIF3特异性引物在中风患者大脑皮层中表达AIF3 mRNA（PCR ID：hAIF3，表2）。k，AIF3蛋白在脑卒中患者皮层的表达。PC，AIF3（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）小鼠的小脑裂解物。l，脑卒中患者AIF3表达蛋白的定量分析。 表2 用于基因分型和定量PCR的引物
3. AIF3剪接开关在体内导致进行性神经退行性疾病
为了确定AIF3剪接在大脑中的作用，我们利用了AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+小鼠，其中AIF3是内源性剪接的，而不是大脑中的AIF。我们比较半合子雄性AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和纯合雌性AIF3剪接小鼠（AIF^fl/fl/CamKIIα-iCre+）及同窝出生小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-或AIF^fl/fl/CamKIIα-iCre-），我们发现雄性和雌性AIF3剪接小鼠均以预期的孟德尔频率出生，并在最初的60天内存活（图3a、b、c、d）。然而，所有AIF3剪接小鼠在P60和P140之间死亡（图3a，b）。在P140之前，没有一个同窝对照动物死亡。此外，所有AIF3剪接小鼠都比同窝对照组小，在P60-P90时体重严重减轻（图3c，d）。采用旷场实验评价大鼠自发运动活动和焦虑样行为，我们发现，在P60-P75之间，小鼠的总行走距离和行走速度没有明显变化。然而，与同窝小鼠相比，AIF3组小鼠的旅行路径和在中心区花费的时间百分比显著减少（图3e、f、g、h），表明AIF3剪接小鼠的焦虑增加。接下来，我们描述了AIF3剪接小鼠的特征，发现在P90处，与同窝对照组相比，AIF3剪接小鼠的脑室增大（图4a）。我们在AIF3剪接小鼠的前脑中观察到实质性的神经退行性疾病，尤其是在体感皮层（图4b，i-i’ & c）、梨状皮质（图4b，ii-ii’ & c）、丘脑（图4b，iii-iii’ & c）和海马体（图4b，iv-vii, iv’-vii’& c）。相反，我们在小脑中未观察到颗粒细胞丢失（图4b，viii, viii’ &c）。CamKIIα 除前脑外，在小脑的Purkinje细胞中高表达。在3个月大的AIF3剪接小鼠中，AIF3的表达显著减少了钙结合蛋白阳性Purkinje细胞的数量（图5）。综上所述，这些数据表明AIF3剪接开关导致小鼠大脑神经退行性疾病。CamKIIα基因表达在出生前可以忽略不计，在P1-P21期增加了10倍，到P90期增加了2.5倍。因此，我们通过Nissl染色比较了AIF3剪接开关对P20、P60和P90神经元丢失的影响。与野生型同窝小鼠相似，AIF3剪接小鼠的皮层或海马在P20处未观察到明显的神经元丢失（图6a，b）。在P60，在AIF3剪接小鼠的皮层（25%）中观察到部分神经元丢失，但在海马中没有观察到（图6a，b）。相反，在P90时，AIF3剪接小鼠的体感皮层（80%）和海马CA1和CA3区域（48%）出现大量神经元丢失（图6a，b）。为了进一步确定P30和P60是否存在特定类型的神经元丢失，我们使用皮质层标记物TBR1（主要在第六层）、CUX1（主要在第二至第三层）和NeuN（一般神经元标记物）进行免疫染色。在P30，AIF3剪接小鼠及其同窝对照小鼠中，我们观察到TBR1和CUX1的表达（补充图3）。AIF3剪接小鼠与其同窝对照组之间的差异不明显。值得注意的是，我们发现TBR1和CUX1的表达在P60时几乎从AIF3皮质层完全消除（图7a，b），尽管NeuN染色（图7c）、DAPI染色（图7）和Nissl染色（图6）仅适度减少。这些结果表明，AIF3剪接开关导致进行性神经退行性疾病，但不明显影响神经分化过程。 图3 AIF和AIF3剪接小鼠的生长和行为特征
a-b，雄性（a，AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+，n=82）和雌性（b，AIF^fl/fl/CamKIIα-iCre+，n=25）AIF3剪接小鼠及其同窝AIF对照组（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-和AIF^fl/fl/CamKIIα-iCre-）的生存曲线。数据以平均数表示，并通过双向方差分析进行统计显著性分析。c-d，雄性（c，n=20）和雌性（d，n=20）AIF3剪接小鼠及其同窝AIF对照组体重的测量。e-h，P60-75时间段对AIF3（n=13）及其同窝对照（n=10）进行野外试验。分析了中心区行程距离（e）、中心区时间百分比（f）、总行程距离（g）和步行速度（h）。 图4 AIF3剪接导致3月龄小鼠前脑严重的神经退行性疾病
a，综述了小鼠脑内神经退行性疾病的典型图像，包括体感皮层、梨状皮层、丘脑和海马（i-ii、i’-ii’、i’’-ii’’）以及小脑（iii、iii’、iii’’）。i-iii，绘制小鼠冠状脑切片的图像。体感（橙色）、梨状皮质（粉色）和丘脑（蓝色）突出显示。i’-iii’同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）Nissl染色图像。i’’-iii’’ AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）Nissl染色图像。b，对AIF3剪接小鼠及其同窝AIF小鼠的体感皮层（i，i’）、梨状皮质（ii，ii’）、丘脑（iii，iii’）、海马（iv-vii，iv’-vii’）和小脑（viii，viii’）进行Nissl染色。i-viii和i’-viii’中的方框以更高的放大倍数显示。c，脑损伤体积的量化（n=5）。 图5 AIF3诱导小脑Purkinje细胞变性
a，通过td-Tomato检测CamKIIα-iCre在Purkinje细胞中的表达。CamKIIα-iCre小鼠与Cre-reporterTd-Ai14小鼠杂交。在6月龄小鼠中，iCre的表达由td-Tomato和Calbindin所指示的Purkinje细胞所指示。顶面板：概述；底部面板：长方体区域的放大率。b，3月龄AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）的钙结合蛋白免疫染色。箭头表示钙结合蛋白阳性的Purkinje细胞。代表性图像来自至少三个独立的实验。c 定量分析AIF和AIF3剪接小鼠小脑相对Purkinje神经元数。 图6 AIF3剪接导致前脑进行性神经退行性疾病
a，AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）第20、60和90天的皮层和海马的典型Nissl染色图像。b，分别在P20，P60和P90对AIF3剪接皮层和海马与WT皮层和海马的神经元丢失区域进行量化。 图7 P60天AIF3剪接小鼠皮层神经元丢失的特征
a，AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）P60天TBR1+神经元的典型图像。b，AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）P60天CUX1+神经元的代表性图像。c， AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）P60天NeuN+神经元的代表性图像。 4. AIF3在皮层神经元中的表达引起体外神经毒性
为了区分AIF和AIF3在神经退行性疾病中的作用，我们制备了Hq小鼠的皮层神经元，并用慢病毒携带Flag标记的AIF或AIF3感染细胞。慢病毒感染3天后，AIF和AIF3蛋白在Hq皮质神经元中的表达相似（图8a）。在慢病毒感染后的第4天，AIF3的表达导致神经细胞死亡，而AIF或GFP的表达没有引起神经毒性（图8b，c）。为了进一步确定内源性AIF3的作用，我们从E15.5 AIF^fl/Y/AIF^fl/fl胚胎制备皮层神经元，然后用携带GFP或Cre-GFP的慢病毒感染（图8d）。慢病毒转导三天后，神经元中成功诱导AIF3，并且AIF表达降低（图8d）。Cre-GFP慢病毒转导后5天，超过50%的神经元死亡，而GFP慢病毒转导的神经元表现出轻微的神经元死亡（图8e，f）。这些数据表明，在体外培养的神经元中，AIF3的表达引起细胞毒性。 5. AIF3剪接开关介导线粒体功能障碍
AIF具有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合和DNA结合的能力，同时也是线粒体内的NADH氧化酶。我们从细菌中表达和纯化GST标记的AIF（62 kDa成熟形式）和AIF3蛋白，然后去除GST标记（图8g），并通过对体外吸光度变化的监测，比较纯化的AIF3和AIF的NADH氧化酶活性。AIF3的NADH氧化酶活性在相同浓度（3 μM）下显著低于AIF（图8h）。AIF和AIF3在378 nm、450 nm处具有典型的FAD结合峰，在467 nm处具有肩部结合峰（图8i）。然而，AIF3（1 μM）的FAD结合亲和力大幅减少（图8i）。与NADH氧化酶活性和FAD结合亲和力不同，AIF3和AIF对DNA的结合能力相似，并导致DNA阻滞（图8j）。这些数据表明，AIF3在体外降低了NADH氧化酶活性和FAD结合能力，但其DNA结合活性保持不变。线粒体内NADH的氧化是ATP合成的关键。为了研究AIF3剪接开关在线粒体呼吸中的作用，我们从AIF^fl/Y/AIF^fl/fl胚胎中制备皮层神经元，并用Cre-GFP慢病毒感染。与转染GFP慢病毒的对照组相比，AIF3剪接开关显著降低了基础耗氧率（图9a）。由于失去AIF，Hq皮质神经元的耗氧率也较低（图9b）。Hq皮质神经元中AIF的表达显著增加了基础耗氧率，而AIF3的表达未能挽救基础耗氧率（图9b）。在Hq皮质神经元中AIF的过度表达增加了ATP的产生，而在Hq皮质神经元中AIF3的表达并不能拯救ATP的产生（图9c）。相反，它甚至显著降低了ATP水平（图9c）。这些数据表明，AIF3至少丧失了部分AIF功能，并导致线粒体耗氧率和ATP生成的失调。为了进一步研究AIF3剪接开关在线粒体功能中的作用，我们用电子显微镜观察了AIF3剪接小鼠P70脑的线粒体超微结构。AIF3剪接小鼠皮层、海马和小脑中的大多数神经元在线粒体形态和嵴组织方面存在严重缺陷（图9d，e）。AIF3剪接小鼠的线粒体直径较大，内膜出现囊泡，而同窝对照小鼠的线粒体完整且组织良好（图9d，e）。与同窝对照组相比，AIF3剪接小鼠前脑、小脑和脑干的线粒体DNA质量显著减少（图9f）。在AIF3和AIF小鼠的心脏和肝脏中未观察到线粒体质量的差异，其中AIF3未表达（图9f；补充图1c）。综上所述，我们的研究结果表明，AIF3剪接开关抑制ATP的产生、氧的消耗和线粒体的生物合成，导致小鼠脑线粒体功能障碍。 图8 体外研究AIF3对皮层神经元的神经毒性作用及其生化特性
a，慢病毒转导3天后Hq皮层神经元中AIF和AIF3的表达。b，碘化丙啶染色显示，慢病毒转导4天后，Hq皮层神经元中AIF3的表达导致神经元死亡。c，慢病毒转导4天后AIF3诱导Hq皮质神经元细胞毒性的定量。d，在GFP或Cre-GFP慢病毒感染（1.0×10⁹ t.U./mL）后3天，AIF fl/fl皮质神经元中AIF3的表达。e，碘化丙啶染色显示，在GFP或CRE-GFP慢病毒感染后5天，AIF^fl/Y/AIF^fl/fl皮质神经元中AIF3的表达导致神经元死亡。f，GFP或CRE-GFP慢病毒感染5天后AIF3诱导的皮层神经元细胞毒性的定量。g，AIF（62 kDa）和AIF3蛋白的纯化。以牛血清白蛋白（BSA）作为纯度和质量控制指标。h，通过监测OD 340 nm处吸光度的变化来确定纯化AIF（3 μM）和AIF3（3 μM）的NADH氧化酶活性。i，波长扫描分光光度法测定纯化AIF（1 μM）和AIF3（1 μM）的FAD结合。j，纯化AIF（3 μM）和AIF3（3 μM）的DNA阻滞分析，用1 kb加DNA梯状体（200 ng）孵育30 min。 图9 AIF和AIF3表达对线粒体功能的影响
a，在GFP或Cre-GFP慢病毒感染后第3天，用1 μM寡霉素，3 μM FCCP和1 μM鱼藤酮处理后检测AIFfl/Y/AIFfl/fl皮层神经元的OCR。b，用1 μM寡霉素，3 μM FCCP和1 μM鱼藤酮处理后用SeahorseBioscience XF24细胞外流量分析仪测定AIF或AIF3慢病毒感染后3天Hq皮层神经元的OCR。c，在AIF或AIF3慢病毒感染后3d，用发光ATP检测试剂盒检测Hq皮层神经元细胞内ATP水平。d，AIF3剪接小鼠皮层、海马和小脑神经元线粒体结构（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）及其同窝对照AIF小鼠（AIFfl/Y/CamKIIα-iCre-）电子显微镜观察。e，AIF3剪接小鼠及其同窝对照AIF小鼠皮层、海马（Hip）和小脑异常线粒体（mito）的定量研究。f，AIF3剪接减少了AIF3剪接小鼠脑内线粒体的生物合成，但没有减少心脏或肝脏的线粒体生物合成。利用细胞色素b（线粒体）和核糖体蛋白S2（RPS2，细胞核）引物，采用实时定量PCR方法测定线粒体DNA与核基因组DNA的比值。将在AIF3剪接小鼠中观察到的数据标准化为同窝对照AIF小鼠。 6. AIF3剪接开关促进染色质凝聚
AIF易位到细胞核，引起染色质凝聚和细胞核收缩，导致细胞死亡。免疫组化和有丝分裂追踪染色研究了AIF3的亚细胞定位。我们发现外源性Flag-AIF和Flag-AIF3在皮层神经元中与内源性AIF共定位（图10a）。同样，如MitoTracker所示，AIF3定位于线粒体，并与MEF中的内源性AIF共定位，其中AIF3的表达没有明显改变线粒体的大小或形态（图10b）。皮层的活体免疫组织化学进一步显示，AIF3定位于线粒体，而在P20的细胞核中仅观察到小部分AIF3。相反，大多数AIF3在P60时易位到细胞核中（图10c，d）。在P90，由于严重的神经元丢失，我们在AIF3剪接小鼠的皮层中检测到少量AIF3染色（图10c，d）。与AIF3不同的是，AIF主要发现于P20到P90的线粒体（图10c，d）。电子显微镜显示，在AIF3剪接小鼠的皮层中，约81%的细胞核显示染色质浓缩和细胞核收缩，这显著高于同窝小鼠（5.3%）（图10e，f）。我们在AIF3剪接小鼠的小脑中也观察到类似的表型（图10e，g）。综上所述，这些数据表明，AIF3容易易位到细胞核，促进染色质凝聚和核收缩，从而增加体内神经元对死亡的敏感性。 图10 AIF3的表达增加了染色质凝聚和细胞核收缩
a，Flag标记的AIF和AIF3的免疫染色及其与皮质神经元内源性AIF的共定位。OE，过度表达。b，MEFs中Flag标记的AIF和AIF3、内源性AIF和mitotracker（mito）的免疫染色。c，AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）AIF小鼠P20、P60和P90皮层中AIF3/AIF的定位变化。d，高倍率图像，用于b中突出显示的区域。e，电子显微镜观察AIF3剪接小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre+）和同窝对照AIF小鼠（AIF^fl/Y/CamKIIα-iCre-）皮层和小脑神经元细胞核的典型图像。f&g，定量分析AIF3剪接小鼠及其同窝对照AIF小鼠前脑（f）和小脑（g）神经元的核收缩。 7. AIF丢失和AIF3获得的协同作用有助于AIF3剪接开关诱导的体内神经退行性疾病
从AIF到AIF3的剪接切换，AIF3涉及到AIF3的获得和AIF的缺失两个事件。接下来我们分析了AIF的缺失、AIF3的获得或两者是否都会导致体内神经退行性疾病。为了研究-AIF的缺失是否主要导致AIF3剪接小鼠的神经退行性疾病，我们以Hq小鼠为模型，因为小鼠脑中AIF的条件性缺失是胚胎致死的，Hq小鼠的AIF减少了80%（图1，补充图1b，c，e）。我们发现，在P100时，雄性Hq小鼠的皮层或海马中未检测到明显的神经元丢失（图11a，b），尽管先前报道了6个月大Hq小鼠小脑中的Purkinje神经元丢失。然而，19.4%的Hq小鼠显示心室增大（图11c），这是在AIF3剪接小鼠中观察到的特征。Hq半合子雄性和纯合子雌性在3-6月龄时体重较小。这些数据表明，AIF的缺失是必要的，但不足以导致在AIF3剪接小鼠中观察到的神经退行性疾病。为了探讨获得性AIF3在AIF引起的神经退行性疾病中的作用，我们采用CRISPR/Cas9技术将loxP-stop-loxPAIF3（LSL-AIF3）序列插入Rosa26基因座，并将这些小鼠与CamkIIα-iCre小鼠杂交，建立了条件性AIF3KI小鼠模型（图12a、b、c）。我们在CamkIIα-iCre+小鼠前脑中诱导杂合AIF3的表达（图12c）。雄性和雌性AIF3KI小鼠在至少7个月内都表现正常。在P105时，在AIF3KI小鼠的皮层和海马中未观察到明显的神经元丢失（图12d）。然而，AIF3KI小鼠的侧脑室增大（图12d），此外，皮层和海马的神经元细胞密度均降低（图12e，f）。在另一种表达神经元细胞特异性nestin-Cre的AIF3 KI小鼠模型中也发现了一致的结果（图12g，h）。含有nestin-Cre+的AIF3 KI小鼠体重较小，但至少存活了7个月（图12i）。尽管在AIF3 KI小鼠（AIF3 KI/nestin-Cre+）的皮质层和海马中检测到侧脑室增大和神经元密度降低，但从P83处的AIF3KI小鼠概况中未观察到实质性神经元丢失，这与我们在AIF3剪接小鼠中观察到的不同（图12j，k，l），表明单独获得AIF3不足以导致体内严重的神经退行性疾病。总之，这些数据表明AIF缺失和AIF3获得的协同效应在AIF3剪接小鼠中引发了神经退行性疾病。 图11 Hq小鼠AIF的丢失并没有明显引起前脑神经退行性疾病
a，Hq小鼠脑（P100）的代表性图像，包括体感皮层、梨状皮层、丘脑和海马。以具有相同遗传背景的C57BL/6j-Aw-J/J小鼠的Nissl染色图像作为对照。b，P100时Hq和对照组小鼠体感皮层和海马的Nissl染色。c，神经元明显缺失或心室增大的小鼠数量的量化。 图12 AIF3KI小鼠模型的特征及其在前脑神经退行性疾病中的作用
a，将LoxP-eGFP/STOP-LoxP-AIF3（LSL-AIF3）插入小鼠Rosa26基因座的策略。sgRosa26-1和Cas9在靶向载体中引入1 kb和4 kb片段之间的双链断裂，用作同源臂。同源性定向修复（HDR）导致LSL-AIF3插入。Cre重组诱导C末端标记的AIF3表达。b， PCR分析7天野生型和AIF3KI雄性和雌性小鼠Rosa26位点的CamKIIα-iCre重组（PCR ID：iCre，Rosa，AIF3，表2）。c，用E1-AIF抗体检测P105雄性WT（AIF3KI^fl/+，CamkII-iCre-）和AIF3KI（AIF3KI^fl/+，CamkII-iCre+）皮层中AIF3的表达。d，P105处WT（AIF3KI^fl/+，CamkII-iCre-）和AIF3KI（AIF3KI^fl/+，CamkII-iCre+）雄性小鼠的Nissl染色概述。e-f，P105时WT（AIF3KI^fl/+，CamkII-iCre-）和AIF3KI（AIF3KI^fl/+，CamkII-iCre+）雄性小鼠皮层和海马的Nissl染色。g，7日龄WT和AIF3KI雄性和雌性小鼠Rosa26基因座nestin-Cre重组的PCR分析（PCR ID：nestin-Cre，Rosa，AIF3，表2）。h，通过E1-AIF抗体测定AIF3在雄性WT（AIF3KI^fl/+，nestin-Cre-）和AIF3KI（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre+和AIF3KI^fl/+，nestin-Cre+）P83的皮质中的表达。i，测量AIF3KI雄性小鼠（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre+，n=17）及其同窝对照小鼠（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre-，n=12）的体重。j，P83天，Nissl染色WT（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre-）和AIF3KI（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre+）雄性小鼠。k-l，P83天，WT（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre-）和AIF3KI（AIF3KI^fl/fl，nestin-Cre+）雄性小鼠皮层和海马的Nissl染色。

讨论

在这里，我们发现了一个新的AIF3亚型，它缺乏Aifm1基因外显子2和3编码的疏水结构域。AIF3是C57BL/6小鼠脑中的一种天然剪接亚型，包含14个外显子，不同于RACE利用人肾cDNA文库鉴定的其他已知AIF亚型。虽然在生理条件下不能检测到AIF3，但我们的研究表明AIF3是由内源性Aifm1基因产生的一种疾病诱导剪接亚型。AIF3在缺氧缺血性或出血性脑卒中的死后脑皮层和缺血性脑卒中后的小鼠脑皮层中诱导表达。然而，缺氧或OGD不能诱导皮层神经元培养中AIF3的表达。胶质细胞在体内不仅提供结构支持，而且还调节胶质递质的释放、神经炎症和代谢。因此，这可能是由于体外培养的神经元缺乏神经元-胶质细胞的相互作用，不能模拟脑缺氧缺血的环境。有趣的是，我们发现当Aifm1基因的外显子3被删除时，AIF3剪接在小鼠大脑中被强烈诱导，这表明Aifm1基因的外显子3对AIF3剪接的调控是至关重要的。Aifm1外显子3缺失小鼠是研究AIF3剪接在脑内生物学功能的一个有价值的模型。这项研究的另一个关键发现是小鼠大脑中的AIF3剪接开关导致神经退行性疾病。AIF3剪接小鼠表现出早发的衰老表型，我们观察到神经元丢失、心室增大和幼年动物行为警觉的现象。所有AIF3剪接小鼠最终在出生后2至4个月死亡。鉴于AIF3在缺氧缺血性脑损伤患者中被诱导，这些患者中的AIF3剪接可能引发神经退行性疾病。中风-痴呆协会显示，约10%的中风患者在1年内出现中风后神经退行性疾病和痴呆症状，中风已被公认为第二常见的痴呆病因。在未来的研究中，他莫昔芬诱导的CamkIIα-CreERT小鼠可以用于诱导缺氧缺血性脑组织中类似水平的AIF3拼接，并可直接研究其对缺氧缺血性脑损伤、卒中后相关神经退行性疾病以及其他线粒体功能障碍相关神经退行性疾病的影响。Hq和AIF3KI小鼠是很有价值的模型，可以让我们直接剖析AIF丢失和AIF3获得在神经退行性疾病中的重要性。我们发现，AIF的丢失和AIF3的增加都不足以引起类似年龄的AIF3剪接小鼠的强烈神经退行性疾病，尽管老年Hq小鼠中AIF的丢失引起小脑的神经退行性疾病已被充分认识。Hq小鼠前脑神经退行性疾病效应不明显的部分原因可能是Hq小鼠在单个细胞中仍有一小部分AIF（20%）支持其基本功能，而AIF3剪接小鼠在CamkIIα-iCRE表达细胞中完全将AIF表达转换为AIF3。由于AIF基因敲除和端脑特异性AIF基因敲除都是胚胎致死性的，因此不能排除这种可能性。另一方面，脑室扩大和前脑神经元轻度减少的观察结果说明AIF3的增加无疑也会导致轻度的神经退行性疾病。此外，在培养的Hq皮质神经元中获得AIF3可导致神经毒性。综上所述，我们的三个动物模型提供了直接证据，证明AIF缺失和AIF3获得的协同效应有助于AIF3剪接小鼠的神经退行性疾病。有趣的是，AIF^fl/fl/AIF^fl/Y小鼠MEFs中的AIF3剪接开关没有显示出明显的细胞毒性，这与AIF3过表达的Hq皮质神经元中的不同。这些AIF3剪接MEF甚至比WT MEF生长更快，细胞外酸化明显增加，表明细胞代谢的改变可能克服AIF3剪接MEF的细胞毒性。线粒体功能障碍通常与神经退行性疾病有关，尽管确切的机制尚不清楚。AIF在线粒体生物能学中起着关键作用，对细胞存活至关重要。线粒体氧化磷酸化降低是不同AIF缺陷小鼠模型中被观察到的一个共同特征，这表明AIF3剪接小鼠的线粒体缺陷至少部分是由AIF丢失引起的，因为AIF3缺乏NADH氧化酶活性和FAD结合亲和力。然而，AIF的缺失不足以完全反映AIF3剪接小鼠的线粒体功能异常，因为AIF的缺失对不同动物模型线粒体结构改变的影响与AIF3剪接小鼠有很大不同。例如，端脑中AIF的缺失改变了线粒体嵴，但不影响线粒体的整体形态，而肝脏和肌肉中AIF的缺失并不能明显改变线粒体的大小、分布或超微结构。AIF3剪接小鼠的线粒体结构整体紊乱，直径增大，内膜囊泡化。与此一致，在Hq皮质神经元中AIF3的过度表达减少了ATP的产生，支持了AIF3获得额外有害功能以促进线粒体功能障碍的观点。在病理条件下，特别是缺血性脑损伤时，AIF从线粒体释放并转运到细胞核中，已被认为是caspase依赖性细胞死亡的关键细胞死亡介质，最终导致染色质浓缩和细胞死亡。AIF3缺乏疏水性结构域，很容易从线粒体释放并转移到细胞核。事实上，我们的研究表明，在AIF3剪接小鼠中，AIF3核易位、染色质浓缩和神经元细胞死亡呈时间依赖性增加。总之，这些发现揭示了线粒体功能障碍和AIF3核易位（由AIF丢失和AIF3获得的协同效应引起）都有助于AIF3剪接引发的神经退行性疾病。

结论

我们在脑内鉴定了一种新的疾病诱导型AIF剪接亚型AIF3，并建立了条件诱导型AIF3剪接小鼠模型。脑内的AIF3剪接开关在神经退行性疾病中起着有害的作用，其机制包括线粒体功能障碍和AIF3核易位引起的神经元死亡，这是由于AIF丢失和AIF3获得的协同作用。AIF3亚型的发现和AIF3剪接小鼠模型的建立，为了解AIF3剪接在大脑老化中的作用提供了有价值的工具，同时也为预防或延缓神经退行性疾病的进展提供了潜在的治疗靶点。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33853653/

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